基因治疗（genetherapy）是指将外源正常基因导入靶细胞，以纠正或补偿缺陷和异常基因引起的疾病，以达到治疗疾病目的。广义上说，基因治疗还可包括从DNA水平采取的治疗某些疾病的措施和新技术，如CAR-T、溶瘤疗法等。基因治疗在对人类健康威胁严重的疾病，包括：遗传病（如血友病等）、恶性肿瘤、心血管疾病、感染性疾病有重要的应用，是当代生命科学中最有前途的热点领域之一，是未来医学的希望。众多的跨国制药公司和基因治疗专业公司纷纷斥巨资加大研发力度，抢占制药领域的制高点。
腺相关病毒和慢病毒是基因治疗最为常用的载体，生产这两种载体都需要质粒作为原材料。在制药水平，每年需要大量的符合质量要求的质粒，以满足当前基因治疗领域的市场需求。然而，目前质粒大规模生产及纯化还存在诸多的挑战（见表1）01质粒商业化生产挑战
质粒通常在重组的大肠杆菌（E.coli）中发酵生产，其纯化工艺一般包括菌体收获、裂解、菌体碎片/固体分离、层析以及澄清和浓缩等步骤，最后得到符合质量要求的质粒。图1.质粒DNA的生产
1.1发酵
为满足商业化要求，质粒发酵通常的方法是尽可能增加大肠杆菌的发酵密度，在高密度培养的发酵中，具有高氧传递速率（OTR）的生物反应器对质粒生产具有重要意义，如溶氧不足不仅可降低质粒产量，还可导致质粒结构的不稳定性，导致开环、聚集体比例提高，这为后续纯化带来很大困难。将发酵溶氧等因素进行优化后质粒产量可达摇瓶的10-50倍。1.2裂解
离心或微滤等技术用于收集发酵液中大肠杆菌。后通过裂解，如碱性裂解或热裂解来释放质粒。碱裂解法是目前应用最为广泛的方法，将菌液置于碱性强阴离子溶液中，使宿主DNA和蛋白质变性，质粒因其特有的环状超螺旋结构，仅破坏碱基对之间的氢键。当pH恢复至中性质粒会发生复性，而宿主DNA不能完全复性，与菌体碎片和已变性的蛋白质结合在一起，采用离心法就能将质粒从菌体裂解液中分离出来。碱裂解是质粒纯化中的关键步骤，也是常出现问题的步骤，局部pH大于12.5会导致质粒不可逆变性。另外，碱裂解控制不当也会导致质粒构型发生变化，影响其转染效率及表达活性。
商业化大规模裂解过程很难控制，工艺重复性差，并可能导致质粒的较大损失。另外该阶段质粒对剪切更敏感，如控制措施不当，超螺旋质粒可能转化为开环或线性变体，影响其质量。
1.3纯化
大肠杆菌裂解释放大量RNA、gDNA片段、蛋白、内毒素及质粒变体。一些分子与质粒DNA的比较相似，使得纯化变得困难。层析法是大规模纯化质粒DNA常用方法，亲和层析可用于分离开环及线性质粒；离子交换层析可用于质粒不同拓扑形态的分离，在药用质粒纯化中应用比较广泛；体积排阻层析可分离出一些小分子的杂质；为提高纯化效果常采用RNase将高分子量RNA降解为寡核苷酸。在基因治疗中需控制质粒宿主DNA、RNA、HCP、内毒素等残留，在质粒纯化中常存在内毒素残留超标等问题。在DNA疫苗中质粒直接注入人体内，这对通过纯化工艺控制上述杂质残留提出了更高的要求，也为纯化工艺提出新的挑战。1.4质量研究质粒作为胞内生物大分子，生产中存在大量杂质，如基因组DNA、RNA、菌体蛋白、内毒素、菌体多糖等。在质粒终产品中的杂质或均不利于转染或增加患者安全性风险，因此，需要将质粒中的杂质控制在一定水平。质粒质量研究中心一个较为棘手的问题是质粒构型分析，典型的质粒有3种不同的构型：共价闭合环形的超螺旋结构（SC构型）；一条链完整，另一条链上有一至数个缺口的开环所呈现的开环构型（OC构型）；双链均断裂所呈现的线性构型（L构型）。OC构型及L构型由于单链或双链断裂导致质粒尺寸增大，导致转染效率或活性低下，故需要控制其比例。常用的质粒构型测定方法有琼脂糖凝胶电泳法（AGE）、离子交换法及毛细管凝胶电泳（CGE）。AGE法能分离SC、OC及L构型，但只是一种半定量分析方法，分辨率有限；离子交换法可以实现不同拓扑形态质粒的分离，分析质粒的含量和拓扑形态，检测质粒的纯度和浓度。质粒不同的拓扑结构也可用毛细管凝胶电泳（CGE）进行区分。02解决方案
无锡生基医药科技有限公司（“生基医药”）是药明康德旗下专注于细胞和基因疗法的CTDMO，致力于赋能全球客户、加速细胞和基因治疗产品研发生产进程。Eppendorf是一家领先的生命科学公司，专注于研发和销售实验室的常规仪器、耗材和服务。Eppendorf生物工艺部门提供用于培养哺乳动物细胞、昆虫细胞、细菌、酵母和真菌的生物过程系统，可覆盖实验室研发、中试放大以及商业化生产的工艺需求。在本次Eppendorf与无锡生基医药共同合作举办系列研讨会中，您可以深入了解质粒大规模制备及高密度细胞培养的工艺开发流程，分享工艺流程中的质量控制关键因素，从而提升最终产物的质量和产量。03系列研讨会
第一期研讨会时间：5月27日19:30-21:00
19:30从研究到商业化的质粒制备及供应整体解决方案
邹萍
生产运营高级主任，无锡生基医药科技有限公司
20:00质粒制备工艺中溶解氧对发酵的影响及控制
Dr.YingYang
SeniorResearchScientist，BioprocessCenterEppendorf,Inc.
20:30QA
21:00活动结束
在本次讲座中，您将能了解到
1.质粒DNA载体大规模制备上游和下游技术，研究、临床及商业化各阶段质粒DNA载体的生产质量控制要求和控制策略2.OXGENE质粒现货解决方案，赋能客户加速慢病毒和腺相关病毒等产品的开发3.质粒的高效制备基于高密度的微生物发酵，溶解氧（DO）在发酵中起到重要作用4.具有高氧传递速率（OTR）的生物反应器可支持不同规模的微生物生长并保证产品产量03系列研讨会03系列研讨会邹萍
生产运营高级主任，无锡生基医药科技有限公司
邹萍，毕业于华东理工大学生物化学专业，于年加入生基医药，担任生基医药生产运营负责人，负责惠山基地生产运营工作。她在生物制药领域具有15年以上抗体类药物的技术开发和生产质量管理经验，擅长蛋白抗体类药物的工艺放大、技术转移、GMP体系建设和项目生产运营管理。在加入生基医药之前，曾供职于三生国健药业（上海）股份有限公司，历任质量保证副总监和生产总监职位，并参与及承担过多项国家和上海市重大课题。
Dr.YingYang
SeniorResearchScientist，
BioprocessCenterEppendorf,Inc.
Dr.YingYangjoinedEppendorfinasaSeniorResearchScientistworkingintheBioprocessApplicationsLab.SheearnedherPhDinBiotechnologyfromWorcesterPolytechnicInstituteinWorcester,MAandMastersinBiologicalandAgriculturalEngineeringfromNorthCarolinaStateUniversityinRaleigh,NC.Laterasapost-docresearcher,sheparticipatedinaUSDAAgricultureandFoodResearchInitiativeCompetitiveGrantfundedprojectatLouisianaStateUniversityAgriculturalCenter.Overtheyears,shehasbuiltherresearchexpertiseinappliedmicrobiologyfocusingonfermentationofbacteria,fungi,andmicroalgaefrombothacademiaandthebioprocessindustry.
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